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Prevalenza, epidemiologia ed allergeni occulti
L’allergia alimentare, disturbo patologico del sistema immunitario, rappresenta un grave problema di salute pubblica in tutto il mondo, con un’incidenza che si spinge fino all’8% nei Paesi occidentali portando a limitazioni nella vita quotidiana e creando un pesante onere per l’assistenza sanitaria [1].
Nello specifico, le allergie alle arachidi e alla frutta a guscio sono tra le più comuni con una prevalenza che varia dallo 0,05% al 4,9% per la frutta a guscio e dallo 0,5% al 3% per le arachidi [2].
La condivisione di parte del patrimonio genetico nelle diverse specie d’interesse causa un fenomeno di cross- reattività e conseguente multi-sensibilità che porta a difficoltà nella gestione diagnostica e terapeutica delle allergie alimentari. Infatti, il 20-30 % delle persone con allergia alle arachidi, sarà allergico ad una o più specie di frutta a guscio e circa il 30% degli individui con allergia ad una specie di frutta a guscio, avrà una o più allergie aggiuntive ad altre specie [3].
Al contempo, i fattori di rischio genetici, epigenetici e ambientali che possono influenzare l’allergia o la sensibilizzazione alimentare sono innumerevoli ma i dati e le statistiche sulla prevalenza sono ancora limitati rispetto all’estensione del problema [4].
Attualmente, l’eliminazione totale o la riduzione dell’assunzione di cibo allergenico da parte degli individui colpiti, rappresenta la migliore strategia terapeutica, nonostante i progressi nei regimi di desensibilizzazione e nello sviluppo di altre terapie [5].
In questo quadro, l’assunzione involontaria di allergeni occulti rappresenta un grave pericolo per la salute dei consumatori allergici ed un problema di sicurezza alimentare.
La presenza di allergeni in tracce può verificarsi in seguito a contaminazione indesiderata delle materie prime o a fenomeni di cross-contaminazione lungo la filiera alimentare, laddove vengono processati anche alimenti allergenici.
Secondo recenti studi la frutta a guscio è tra i più frequenti contaminanti degli alimenti e la contaminazione accidentale rappresenta la maggiore causa di insorgenza di reazioni allergiche [6].
Alcune proteine della frutta a guscio sono annoverate fra i più potenti allergeni in grado di innescare severe reazioni avverse, a volte letali, nei soggetti predisposti. Tale minaccia assume notevole importanza, considerando non solo le problematiche analitiche circa la rivelazione delle loro tracce, ma anche l’assenza di livelli soglia che possano scongiurare l’insorgenza di allergie alimentari in soggetti predisposti e di reazioni immunologiche avverse più o meno gravi nei soggetti già conclamati allergici.
Quadro normativo
Al fine di garantire la salute e la sicurezza dei consumatori, nel 2011 è stato emanato dall’Unione Europea, il Regolamento UE 1169/2011 che richiede la dichiarazione in etichetta di 14 classi di allergeni e prodotti correlati, se utilizzati come ingredienti o se si sospetta che possano essere presenti come contaminanti.
Tra queste vi è la classe “frutta a guscio” che include 9 specie diverse e la classe delle arachidi, appartenenti alla famiglia delle leguminose.
L’estrema variabilità interindividuale da pochi milligrammi a qualche grammo, e la variabile sensibilità ai differenti epitopi di una stessa proteina, sono la causa dell’assenza di un quadro normativo per la gestione degli allergeni occulti che ha spinto l’industria alimentare a fare un uso eccessivo dell’etichettatura precauzionale per gli allergeni (PAL), portando ad una perdita di fiducia dei consumatori e allo stesso tempo, ad una sottovalutazione della possibile presenza dell’allergene dichiarato nell’alimento acquistato [7].
In effetti, le frasi precauzionali hanno raggiunto una tale ubiquità che molti genitori di bambini allergici le ignorano.
D’altra parte, definire linee guida per gestire la presenza di allergeni nascosti nei prodotti alimentari su base quantitativa è un compito molto complicato.
Recentemente, vari Paesi hanno fissato soglie giuridiche, attraverso un approccio basato sul cosiddetto no observed adverse effect level (NOAEL) e sul low observed adverse effect level (LOAEL), ovvero le soglie VITAL (Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling), che non hanno uno status normativo: sono fissate a 2,5 mg per kg per le proteine della frutta a guscio, 5 mg per kg per le proteine di arachidi e 50 mg per kg per le proteine dell’anacardo) [8].
Sebbene queste dosi di riferimento non siano ancora state standardizzate, i laboratori e le autorità alimentari le utilizzano come soglie indicative per sostenere decisioni, come nel caso dei richiami alimentari.
Dai metodi classici alle nuove frontiere analitiche
Lo sviluppo di tecniche analitiche sempre più sensibili, rapide ed affidabili, in grado di identificare e quantificare componenti allergenici (nascosti o meno) nei prodotti alimentari anche a basse concentrazioni, può supportare fortemente la valutazione delle soglie.
Le tecniche maggiormente utilizzate per l’analisi degli allergeni proteici sono quelle immunochimiche, di biologia molecolare e approcci basati sulla spettrometria di massa accoppiata alla cromatografia.
Tra i metodi immunochimici, i test ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) sono i più diffusi e si basano sul legame antigene-anticorpo. Sebbene queste tecniche siano molto sensibili e veloci, l’alterazione della struttura proteica come la perdita di epitopi conformazionali e la distruzione dei siti di riconoscimento, possono generare risultati falsi negativi. Inoltre, la reattività crociata dell’anticorpo con sostanze sconosciute non può essere completamente esclusa e originerà, in questo caso, risultati falsi positivi [9].
I metodi di biologia molecolare basati sulla PCR (Polymerase Chain Reaction) ovvero sulla tecnica di amplificazione del DNA genomico totale di un alimento attraverso la reazione a catena della polimerasi, forniscono un’identificazione indiretta della proteina allergenica in quanto si ricercano i geni che codificano per la stessa.
Poiché la reazione allergica è provocata dalle proteine e non dal DNA, la PCR può portare a risultati falsi nei casi in cui il DNA e le proteine allergeniche siano influenzati in modo differente dai processi tecnologici.
Con i progressi raggiunti mediante la RT-PCR è possibile la determinazione semi-quantitativa / quantitativa degli allergeni nelle matrici alimentari, con interessanti applicazioni nelle analisi di routine [10].
Grazie alla sua potenziale capacità di superare i limiti di applicazione dei metodi citati, la spettrometria di massa (MS) è diventata sempre più rilevante nell’analisi degli allergeni proteici.
La MS ha la capacità di identificare le molecole target in base ad una proprietà molecolare intrinseca, la massa, mantenendo buona sensibilità nella rivelazione.
Questa tecnica consente, inoltre, la quantificazione multipla delle proteine allergeniche attraverso i corrispondenti marcatori peptidici, una strategia favorita dall’accoppiamento tra cromatografia liquida con un alto potere separativo e la MS dall’elevato potere identificativo (LC-MS) [11].
I due comparti sono collegati da un’interfaccia che assume un ruolo chiave, basata sulla Ionizzazione Elettrospray (ESI), perfetta per l’analisi di macromolecole come le proteine, in quanto non distruttiva ed in grado di caricarle in modo multiplo, fornendo un caratteristico spettro multi-carica (ossia con più picchi, in base allo stato di carica complessivo raggiunto dalla proteina analizzata) (Fig 3).
Oltre alle informazioni sul peso molecolare, la MS con interfaccia ESI può consentire di risalire alla sequenza amminoacidica delle proteine attraverso l’analisi dei peptidi.
In sintesi, i peptidi ottenuti dalla digestione enzimatica artificiale (tripsina) degli allergeni proteici bersaglio, vengono separati mediante Liquid Chromatography (LC), eluiti dalla colonna e ionizzati nell’ interfaccia ESI, prima di essere introdotti nello spettrometro di massa.
Attraverso l’elaborazione dei dati mediante algoritmi di ricerca nei database proteici e mediante l’interpretazione dei modelli di frammentazione ottenuti attraverso la spettrometria di massa tandem, è possibile chiarirne l’identità.
Infatti, l’identificazione della proteina diventa ancora più affidabile se informazioni circa la sequenza di ciascuno dei peptidi ottenuti, possono essere ricavate frammentandone il rispettivo ione, attraverso la spettrometria di massa tandem (MS/MS).
In figura, l’allineamento dei picchi relativi a diversi frammenti del medesimo peptide, ne conferma inequivocabilmente l’identità (Fig 4).
La quantificazione assoluta degli allergeni alimentari richiede una calibrazione e standard adeguati, per compensare gli effetti sulla rilevabilità peptidica causati dalla matrice alimentare e dalla sua storia produttiva.
La selezione dei marker peptidici avviene secondo criteri ben studiati ed è uno dei passaggi più importanti per la messa a punto di un metodo analitico solido e sensibile.
Ultimamente la spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione basata su tecnologia Orbitrap è stata applicata all’analisi multipla di allergeni in prodotti alimentari, fornendo risultati molto promettenti con limiti di rivelabilità (LOD) dell’ordine dei µg [12].
Conclusioni
La MS consente di monitorare la presenza di più specie allergeniche in un’unica analisi. Nonostante i costi strumentali elevati e la necessità di personale altamente qualificato, è un potente mezzo per garantire la sicurezza alimentare, tutelare innanzitutto la salute dei consumatori allergici ma anche l’economia delle aziende produttrici.
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[1] Sicherer, S.H.; Sampson, H.A. Food allergy: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and treatment. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2014.
[2] Midun, E.; Radulovic, Brough, S.H.; Caubet, J.C. Recent advances in the management of nut allergy. World Allergy Organization Journal, 2021.
[3] Clark, A.T.; Ewan, P.W. The development and progression of allergy to multiple nuts at different ages. Pediatric allergy and immunology, 2005.
[4] Sicherer, S. H.; Sampson, H. A. Food allergy: a review and update on epidemiology, pathogenesis, diagnosis, prevention, and management. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2018.
[5] Bauer, R.N., et al. The future of biologics: applications for food allergy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2015.
[6] Taylor, S.L.; Baumert, J.L. Cross-contamination of foods and implications for food allergic patients. Current allergy and asthma reports, 2010.
[7] DunnGalvin, A., et al. Precautionary allergen labelling: perspectives from key stakeholder groups. Allergy, 2015.
[8] Taylor, S. L., et al. Establishment of reference doses for residues of allergenic foods: report of the VITAL expert panel. Food and Chemical Toxicology, 2014.
[9] Wei, Y.; Sathe, S. K.; Teuber, S. S.; Roux, K. H. A sensitive sandwich ELISA for the detection of trace amounts of cashew (Anacardium occidentale L.) nut in foods. Journal of agricultural and food chemistry, 2003.
[10] Monaci, L.; Visconti, A. Immunochemical and DNA-based methods in food allergen analysis and quality assurance perspectives. Trends in Food Science & Technology, 2010.
[11] Huang, X. et al. Simultaneous determination of multi-allergens in surimi products by LC-MS/MS with a stable isotope-labeled peptide. Food Chemistry, 2020.
[12] Monaci, L., et al. Towards the quantification of residual milk allergens in caseinate-fined white wines using HPLC coupled with single-stage Orbitrap mass spectrometry. Food Additives & Contaminants: Part A, 2011.
Anna Luparelli
Dottoranda in Scienze del Suolo e degli Alimenti presso il dipartimento di Chimica e ISPA-CNR di Bari, si occupa dello sviluppo di metodi innovativi che utilizzino tecnologie avanzate basate sulla spettrometria di massa tandem, per la rivelazione multi-target di allergeni di frutta a guscio, in prodotti da forno.
